發(fā)布時間：2023-07-17
2023年7月17日，《自然·方法》期刊在線發(fā)表了中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學研究所）、神經(jīng)科學國家重點實驗室陳躍軍研究組題為《利用CRISPR條形碼技術(shù)全面繪制小鼠腦內(nèi)的單細胞時空譜系》的研究論文。該研究通過建立能夠應用于小鼠體內(nèi)任意組織器官的譜系示蹤新技術(shù)——CREST，解析了小鼠中腦在胚胎發(fā)育過程中的單細胞時空譜系圖譜，揭示了小鼠中腦發(fā)育過程中新的譜系分化路徑和分子調(diào)控機制。CREST技術(shù)為高通量解析小鼠組織器官發(fā)育的單細胞譜系提供了全新的工具，為從譜系視角研究各種發(fā)育疾病的發(fā)病機制提供了新的研究工具。
哺乳動物的發(fā)育伴隨高度復雜的細胞命運特化過程——從多潛能干細胞逐步分化成熟為各種類型的細胞，進而形成高度異質(zhì)性的組織器官。解析每個細胞在這一過程中的完整發(fā)育歷程（即“譜系”）是發(fā)育生物學領(lǐng)域的重要目標之一。譜系的研究有助于人們理解生命個體的發(fā)育，解析發(fā)育相關(guān)疾病的發(fā)病機制，并為基于細胞治療的再生醫(yī)學研究中不同類型細胞藥物的體外分化和制備，提供關(guān)鍵依據(jù)和線索。
近年來，人們?yōu)榻馕霾溉閯游锷窠?jīng)系統(tǒng)的譜系做出了巨大努力。然而，傳統(tǒng)基于重組酶技術(shù)的譜系示蹤通量有限，一般只能示蹤1-2個譜系。最近的一些研究通過在側(cè)腦室注射條形碼標記的病毒，對腦室區(qū)（Ventricular Zone，VZ）的神經(jīng)干細胞進行標記，并結(jié)合單細胞測序?qū)@些細胞的子代細胞進行高通量譜系示蹤。然而，這種方法只能標記VZ區(qū)的神經(jīng)干細胞，無法實現(xiàn)對全腦任意腦區(qū)神經(jīng)干細胞的標記，而且用病毒注射的方法標記早期胚胎中的細胞還存在技術(shù)障礙。因此，急需開發(fā)一種能夠?qū)δX內(nèi)任意細胞群體進行高通量條形碼標記和譜系示蹤的新方法。
陳躍軍研究團隊針對以上問題，通過將CRISPR條形碼技術(shù)、重組酶系統(tǒng)和單細胞測序技術(shù)相互結(jié)合，開發(fā)了一種在體高通量譜系示蹤的方法——CREST，并構(gòu)建了相應的譜系示蹤工具小鼠品系（圖A）。利用CREST技術(shù)，研究團隊繪制了較全面的中腦發(fā)育譜系圖譜，有助于深入理解中腦多種類型細胞的發(fā)育過程。
研究團隊首先利用基于CREST的“快照”策略（snapCREST），解析了特定發(fā)育時間點中腦不同細胞類型之間的譜系關(guān)系（圖B），發(fā)現(xiàn)了許多先前未被報導的具有亞區(qū)特異性的譜系關(guān)系：在翼板中，谷氨酸能神經(jīng)元與GABA能神經(jīng)元具有共同的譜系起源；而在基板中，這兩類神經(jīng)元具有相對獨立的起源；在底板中，谷氨酸能神經(jīng)元則與多巴胺能神經(jīng)元具有共同的起源（圖C）。研究團隊進一步在克隆水平對祖細胞的分化命運進行了無偏好的分類，發(fā)現(xiàn)單個中腦祖細胞的分化命運可以被分為六種主要類型。基于這一結(jié)果，研究團隊提出了“祖細胞原型”的概念，這六種中腦祖細胞原型囊括了中腦發(fā)育過程中單個中腦祖細胞的不同分化命運（圖D）。研究團隊進一步在克隆水平對中腦底板神經(jīng)祖細胞的分化命運進行了分析，發(fā)現(xiàn)單個中腦底板神經(jīng)祖細胞存在三種不同的分化命運：中腦底板神經(jīng)祖細胞經(jīng)由中腦底板神經(jīng)母細胞，有的偏好分化成多巴胺能神經(jīng)元，有的偏好分化成谷氨酸能神經(jīng)元、有的則能同時分化成多巴胺能和谷氨酸能神經(jīng)元。通過對不同分化命運的底板神經(jīng)母細胞差異表達基因的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，Pbx1轉(zhuǎn)錄因子在偏好產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元的底板神經(jīng)母細胞內(nèi)顯著高表達（圖E）。當Pbx1被敲除后，共釋放谷氨酸的中腦多巴胺能神經(jīng)元的比例顯著增加，這證明Pbx1在決定中腦底板來源神經(jīng)元的谷氨酸能表型和多巴胺能表型中的關(guān)鍵作用（圖F）。這些結(jié)果展示了CREST技術(shù)在克隆水平解析細胞命運決定分子機制中的強大能力。
snapCREST可以解析特定發(fā)育時間點不同細胞類型之間的譜系關(guān)系，但是由于祖細胞在被用于單細胞測序后無法繼續(xù)分化，這一策略無法解析不同祖細胞類型在下一階段的分化命運。為此，研究人員進一步開發(fā)了基于CREST的“連拍”策略（pandaCREST）。該策略結(jié)合了克隆分離策略、類器官培養(yǎng)技術(shù)與CREST技術(shù)，實現(xiàn)了發(fā)育過程中單個祖細胞轉(zhuǎn)錄組信息及其分化潛能的同時獲得（圖G）。通過pandaCREST，研究人員解析了中腦不同轉(zhuǎn)錄組定義的祖細胞群的分化命運。進一步的單克隆分析發(fā)現(xiàn)，在同一轉(zhuǎn)錄組定義的祖細胞群內(nèi)，單個祖細胞具有不同的分化命運，并且在轉(zhuǎn)錄組水平上，不同分化命運的祖細胞仍存在微小的差異，提示同一祖細胞類群內(nèi)單個細胞的不同分化命運是預先確定的（圖H）。
CREST技術(shù)是一種高通量譜系示蹤的新方法，它不僅可以在單細胞水平解析體內(nèi)的發(fā)育譜系，而且可以在克隆水平解析發(fā)育過程中命運決定的分子機制，是目前已知的唯一可以對腦內(nèi)任意細胞群體進行高通量譜系示蹤的方法，為解析全腦發(fā)育譜系圖譜提供了關(guān)鍵技術(shù)。通過將CREST 小鼠與任意組織器官或特定類型細胞的Cre/CreER小鼠交配，CREST技術(shù)可以被廣泛地應用于其他組織器官的發(fā)育譜系研究，并可以用于疾病、損傷或再生條件下的譜系研究。這為在單細胞和單克隆水平研究不同組織器官的發(fā)育和疾病發(fā)生提供了通用技術(shù)方法。
該研究由中國科學院腦智卓越中心博士研究生謝連順與中國科學院營養(yǎng)健康所博士研究生劉恒心，在腦智卓越中心陳躍軍研究員和臨港實驗室魏武研究員的指導下完成。中國科學院腦智卓越中心游致文博士、王露悅博士、李依紋博士、博士研究生章馨月、何慧博士、職工袁停立、鄭文平博士，復旦大學兒科醫(yī)院研究生計筱珊，上海躍賽生物科技有限公司吳子彥博士，復旦大學腦科學研究院熊曼研究員，復旦大學周文浩教授，中國科學院腦智卓越中心蒲慕明院士為本研究提供了重要幫助。該研究得到了中國科學院、科技部、基金委和上海市科委的資助。
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